AGRICULTURA. La metagenómica en agricultura: procedimientos y técnicas

La metagenómica en agricultura. Procedimientos y técnicas

 

Nociones sobre qué es y cómo se aplica la metagenómica y cómo estas técnicas de identificación de microorganismos ha supuesto un antes y un después.

09 noviembre 2023.- La pérdida de biodiversidad de organismos asociados a los agroecosistemas supone un tema de preocupación a nivel mundial. Su restauración resulta crucial para que la calidad y productividad alimentaria sea sostenible a largo plazo.

Las herramientas tradicionales disponibles hasta ahora para la identificación y caracterización de microorganismos, como las técnicas de cultivo o identificación por imágenes y morfología, han supuesto un gran avance en el conocimiento de la microbiota, incluso sobre ciertos microrganismos que son considerados no cultivables con el empleo de métodos basados en la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Handelsman, 2004). Sin embargo, desde hace algunos años, se está empleando una técnica revolucionaria, la metagenómica, como una herramienta eficaz y precisa para identificar los microorganismos presentes en cualquier ambiente (Wooley et al. 2010).

En este articulo trataremos de dar unas nociones sobre qué es y cómo se aplica la metagenómica en diferentes ámbitos, pero sobre todo como estas técnicas de identificación de microorganismos ha supuesto un antes y un después en la búsqueda de microorganismos que resulten útiles para lograr una agricultura más eficiente y sostenible con el medio ambiente.

2.- ¿Qué es la metagenómica?

Antes de explicar en qué consiste la metagenómica daremos unas nociones básicas de genética. ¿Qué es la genética? La genética es la ciencia que estudia los genes y la herencia genética, es decir, cómo ciertos rasgos fisiológicos se heredan de padres a hijos.

¿Qué es la genética molecular? La genética molecular es una rama de la genética que estudia todo lo relacionado con los genes, replicación, regulación y expresión, a nivel molecular.

¿Qué es un gen? Según el Instituto Nacional del Cáncer, un gen es la unidad funcional y física de la herencia que pasa de padres a hijos. Los genes están formados por ADN que tienen información genética específica y se hallan dispuestos en un orden fijo a lo largo de un cromosoma.

¿Qué es un cromosoma? Un cromosoma es una estructura en forma de madeja de hilo compuesta por proteínas y una molécula de ADN que transporta la información genética en las células eucariotas.

¿Qué es el ADN? El ADN (ácido desoxirribonucleico) es el portador de la información genética y consta de una sucesión de nucleótidos. El ADN se encuentra en el núcleo de las células y su estructura son dos cadenas iguales, pero antiparalelas unidas entre sí mediante las bases nitrogenadas por medio de puentes de hidrógeno, formando una doble hélice. El ADN contiene el código para crear y mantener a los organismos vivos. Todas las células de los humanos tienen ADN en su núcleo, excepto los glóbulos rojos y las plaquetas, porque son células sin núcleo.

¿Qué es un nucleótido? Un nucleótido es una molécula constituida por una base nitrogenada, un azúcar y una molécula de ácido fosfórico. La información genética está contenida en el orden exacto de los nucleótidos.

¿Qué es el ARN? El ARN (ácido ribonucleico) es un ácido nucleico formado por una cadena simple de ribonucleótidos. Está presente en todas las células tanto procariotas (bacterias) como eucariotas (resto de seres vivos). Es el único material genético de ciertos virus y tiene la función de mensajero de la información genética y el que lleva a cabo la síntesis de proteínas, las cuales son necesarias para la función, regulación y estructura de los tejidos y órganos de los organismos.

¿Qué es la genómica? La genómica es el conjunto de disciplinas relacionadas con el estudio de los genomas y su aplicación a la biotecnología, terapia genética, etc.

¿Qué es un genoma? El genoma es el conjunto de genes de un organismo. A modo de ejemplo, el genoma humano contiene más de 25.000 genes.

La diferencia entre genética y genómica es que, la primera estudia a los genes de forma individual, mientras que la segunda estudia el conjunto de todos los genes de un organismo.

Entonces, ¿Qué es la metagenómica?

La metagenómica, ecogenómica o genómica comunitaria es un conjunto de técnicas que surge como una rama de las ciencias genómicas a finales del siglo XX. Son técnicas que persiguen obtener el material genético, ADN y ARN, de una comunidad microbiana presente en un ecosistema y que no son, en la mayoría de los casos, cultivables en el laboratorio. De hecho, cerca del 99% de los microorganismos existentes en los ecosistemas viven en comunidades mixtas y no son cultivables en el laboratorio.

La metagenómica no sólo nos permite identificar los microorganismos presentes en un ecosistema para así obtener una biblioteca genética (genotecas) de la microbiota presente, sino que también nos permite conocer sus funciones y su rol biológico dentro de la comunidad a la que pertenecen, al mismo tiempo que nos evita tener que aislar y cultivar cada especie por separado en el laboratorio (Nielsen et al. 2014). Por lo que, la metagenómica abre nuevas vías de investigación a ambientes poco conocidos como el marino, donde reside una gran diversidad microbiana que podría suponer una fuente genética importantísima para la industria farmacéutica, biotecnológica o agrícola.

3.- Procedimientos y técnicas en la metagenómica

A principios de la década de 1970, el estudio del ARN ribosómico (ARNr), mediante el empleo de la secuenciación de un solo gen (ADNr), dio lugar a la filogenia y taxonomía bacteriana. Este tipo de técnica está basado en la secuenciación del gen bacteriano ADN ribosómico 16S (ADNr 16S). Este tipo de gen ribosomal está altamente conservado en las bacterias y, evolutivamente hablando, es estable. Por lo que, es la macromolécula que más se emplea para establecer las relaciones filogenéticas existentes entre las distintas bacterias de una muestra y nos permite clasificarlos en géneros y especies de forma rápida y precisa, ya que son secuencias específicas de oligonucleótidos. Estos constan de hasta 10 nucleótidos y son la firma, de un determinado grupo filogenético, ya que sólo están presentes en ellos y no en otro grupo.

En microbiología clínica, se suele emplear este tipo de secuenciación del gen ADNr 16S fundamentalmente para la identificación de bacterias, que con otras técnicas convencionales como el cultivo en el laboratorio y posterior caracterización fenotípica no es posible o requiere de mucho tiempo. El ADN para la secuenciación del gen 16S preferentemente proviene de cultivos puros de la bacteria, aunque también puede provenir de muestras clínicas directamente de órganos o tejidos, en el caso de bacterias no cultivables. Existen protocolos generales para la extracción de ADN bacteriano, pero según la bacteria pueden requerirse protocolos específicos.

El método de identificación bacteriana mediante la secuenciación del ADNr 16S comprende tres etapas:

Amplificación del gen ADNr 16S, mediante un termociclador y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Determinación de la secuencia de nucleótidos y acomodación de las secuencias similares en OTUs, unidad taxonómica operativa.

Fig.1: Etapas del método de identificación de bacterias mediante la secuenciación de un solo gen (ADNr 16S)

Análisis de las secuencias, mediante la comparación de la secuencia de ADNr 16S con bases de datos, como GenBank, EMBL, RPD, RIDOM, etc.

Pero, el primer método realmente eficaz que permitió la secuenciación de genomas completos fue el diseñado por Frederick Sanger (1977), denominado “Método de Sanger o de didesoxinucleótidos” (Sanger et al. 1975). Este método se basa en la acción de una enzima, ADN polimerasa, que añade nucleótidos marcados y se obtienen fragmentos de ADN de diferentes tamaños que, tras una electroforesis capilar en gel, se separan las moléculas en un gel de agarosa por su carga o tamaño, dándonos una serie de bandas que se analizan con escalas estándar de fragmento de tamaño conocido. Este método ha sido el método de secuenciación más empleado por los científicos en el siglo XX y el que permitió la posterior automatización de la secuenciación y el desarrollo de herramientas informáticas de análisis del genoma. Más tarde, en 1982, Sanger empleo otro procedimiento de secuenciación “Secuenciación de escopeta o shotgun sequencing”, para secuenciar al bacteriófago lambda y, posteriormente, Putney lo empleó para secuenciar proteínas musculares (Putney et al. 1983).

Fig. 2: Etapas del método de secuenciación de escopeta o shotgun sequencing.

La secuenciación de escopeta o shotgun sequencing es una técnica que consiste en romper al azar el genoma en una serie de pequeños fragmentos de ADN, para después ordenarlos de forma individual y correcta, mediante un programa informático, para reconstruir el genoma. Es un método que se suele emplear en microbiología y mediante el cual podemos conocer la información metabólica y funcional de cada especie de microorganismo, así como evaluar la diversidad y abundancia de estos en un ambiente en concreto. Además, con este tipo de secuenciación podemos identificar cepas de microorganismos poco abundantes o nuevos.

Este método suele emplearse para secuenciar fragmentos individuales de ADN como, por ejemplo, plásmidos de bacterias, o ADN copiado por PCR.

A pesar de las limitaciones que presenta el método como, por ejemplo, el empleo de geles de electroforesis, análisis en paralelo de pocas muestras, difícil de automatizar y su alto costo, entre otras, el “Método de Sanger” asentó las bases científicas para el desarrollo posterior de nuevos métodos de secuenciación durante la primera década del siglo XXI.

A los primeros métodos de secuenciación masiva que surgieron después del “Método de Sanger” se les denomino NGS (Next Generation Sequencing). La mayoría de ellos se basan en la síntesis de moléculas de ADN, como el Método de Sanger, pero difieren de este en que la secuenciación es por pirosecuenciación, ligación o síntesis.

La primera tecnología de NGS o de segunda generación que apareció en el mercado a principios del siglo XXI, equipo Roche 454 GS de la compañía Life Sciences-Roche, se basó en el método de Pirosecuenciación (Hyman, 1988). Este método, que se desarrolló a finales de 1980, consiste en la detección de pirofosfatos que se liberan durante la síntesis de ADN. Fue la primera alternativa al “Método de Sanger” que por su rapidez, precisión, flexibilidad y fácil automatización rápidamente se implanto para llevar a cabo la secuenciación de ADN de diferentes organismos.

Más tarde, en el año 2007, se comenzó a emplear un nuevo método de secuenciación, la secuenciación por ligación (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection), con el equipo SOLID de Life Technologies. Este método enzimático se fundamenta en la ligación de oligonucleótidos por una enzima denominada ADN ligasa. También surgió en el 2006 otro método de secuenciación, el método de secuenciación por síntesis o polimerización (SBS) (Mitra et al. 2003), con nuevas tecnologías desarrolladas por Solexa e Ilumina. Este método emplea la detección fluorescente de nucleótidos y es el método de secuenciación que más se utiliza en los secuenciadores que fueron comercializados posteriormente como el MiSeq, HiSeq, NextSeq, Nova Seq y MiniSeq, por su gran rentabilidad y alta precisión.

A partir del 2014 surgieron nuevos secuenciadores denominados de tercera generación que emplean el método de secuenciación de molécula única (Single Molecule Real-Time, SMRT). Esta metodología emplea la fluorescencia para secuenciar una única molécula de ADN que nos permite secuenciar moléculas más largas y en tiempo real.

En el 2016, surgió una nueva tecnología de secuenciación, la secuenciación de nanoporos, que nos permite secuenciar ADN de forma individual empleando nanoporos o poros de proteínas en una membrana eléctricamente resistente, aunque todavía está en desarrollo.

Todos estos métodos de tercera generación tienen en común que eliminan la etapa de amplificación del ADN por PCR y realizan la secuencia a partir de una única molécula de ADN, por lo que se abaratan los costos de la secuenciación y se pueden analizar lecturas más largas de nucleótidos. Pero, presentan una gran limitación y es que se requiere de una gran cantidad de muestra de ADN para poder realizar la secuenciación y, así, obtener resultados fiables.

4.- Ventajas y desventajas de la metagenómica

Si comparamos los métodos de diagnóstico tradicionales (técnicas de cultivo o identificación por imágenes y morfología) con la metagenómica NGS (mNGS), esta última nos ofrece la gran ventaja de poder identificar una mayor diversidad genética de microorganismos presentes en un ambiente, que muchos de ellos no son conocidos, y de forma simultánea. También, la mNGS nos permite predecir la resistencia de microorganismos patógenos a compuestos que se podrán emplear para su supresión o control. Por tanto, la metagenómica se muestra como una herramienta útil para acceder a la gran biodiversidad genética de muestras de ambientes poco conocidos o inaccesibles como el aéreo o acuático, así como constituir una herramienta fundamental para la construcción de bibliotecas genéticas que podrán tener multitud de aplicaciones industriales.

Sin embargo, la metagenómica presenta unas desventajas grandes y que son inherentes a ella como que: son técnicas costosas, propensas a errores, que requieren de grandes cantidades de ADN sin procesar para la secuenciación y que los datos de la información genética generada son escasos. Pero también, la metatranscriptómica, el estudio de la expresión génica de los microorganismos, el ARN mensajero (ARNm), es decir, la funcionalidad de los microorganismos en su conjunto, está limitada por la corta vida media del ARNm.

5.- La metagenómica en agricultura

En la agricultura, es bien conocido que, los microorganismos presentes en la rizosfera del suelo juegan un papel muy importante en procesos vitales para los vegetales como los ciclos de los nutrientes del suelo, así como para el control de ciertas enfermedades bióticas. Pero, el empleo de la metagenómica para identificar comunidades enteras de microorganismos presentes en un suelo en particular y las relaciones que entre ellos existen, que de forma tradicional no ha sido posible concretar, ha supuesto un avance científico sin precedentes. Y ¿Por qué ha sido un avance sin precedentes? Porque, mediante la metagenómica, los científicos han sido capaces de identificar microorganismos nuevos existentes en los suelos, que hasta ahora no se conocían por la incapacidad de su aislamiento, de una forma eficiente y a bajo coste, y han sido capaces de demostrar que la interrelación entre los microorganismos de una comunidad es vital para el crecimiento de las plantas (Rincón-Florez et al. 2013).

Un ejemplo de ello, son los estudios llevados a cabo por el Consorcio Internacional de Microbiomas de Cítricos, que se constituyó en el 2015, y que participaron ocho países productores de seis continentes diferentes. El objetivo de este Consorcio fue determinar los microrganismos presentes en la rizosfera de cítricos empleando la metagenómica. El estudio puso de manifiesto que, a pesar de que las muestras procedían de siete tipos de suelos diferentes, con climas diferentes y con contenidos en carbono, nitrógeno y fósforo diferentes, el microbioma de los cítricos estaba formado por microorganismos pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium, Agrobacterium, Mesorhizobium, Sphingomonas, Cupriavidus, Bradirhizobium, Cellvibrio, Paraburkholderia y Variovorax.

Otro estudio llevado a cabo por Tsurumaru y col., en el 2015, en Beta vulgaris L. (remolacha azucarera), lograron identificar las bacterias y genes promotores de su crecimiento mediante la metagenómica. Los géneros bacterianos que encontraron de forma más abundante fueron Streptomyces, Bradyrhyzobium y Mesorhizobium.

El género Streptomyces son bacterias Grampositivas y quimiorganotróficas, que están ampliamente distribuidas en el medio ambiente y son capaces de producir metabolitos secundarios con propiedades antibacterianas (estreptomicina, cloranfenicol, fosfomicina, etc.), antifúngicas (natamicina, nistatina, etc.), antiparasitaria (ivermectina), antitumorales e inmunosupresoras. Además, son claves para el reciclaje de las paredes celulares de hongos y vegetales, y algunas especies tienen relaciones simbióticas con insectos o plantas.

El género Bradyrhyzobium son bacterias Gramnegativas, siendo muchas de ellas fijadoras de nitrógeno atmosférico simbiontes con leguminosas. Y el género Mesorhizobium son bacterias Gramnegativas y también fijan nitrógeno atmosférico

Los genes que de forma mayoritaria se expresaron en la promoción del crecimiento de la remolacha azucarera fueron genes que están involucrados en la supresión de enfermedades de las plantas y que actúan como antibióticos y antifúngicos, como el gen β-1,3-gluconasa, que está relacionado con la codificación de la quitinasa, el gen que codifica la quinoproteina glucosa deshidrogenasa y el gen que codifica el isocrorismano piruvato liasa.

Otros estudios, como el llevado a cabo por los autores Ambardar y col. (2016) determinaron la diversidad fúngica asociada con el cultivo de azafrán (Crocus sativus L) mediante metagenómica. También, los autores Kumar y col, en el 2018, emplearon la metagenómica para identificar microorganismos presentes en suelos sembrados con alfalfa y cebada contaminados por petróleo. En ellos encontraron Proteobacterias del género Alcanivorax (degrada alcanos) y Bacteroidota del género Aequorivita, que son empleados en la fitorremediación de suelos al ser capaces de degradar hidrocarburos.

Estudios más recientes llevados a cabo por Dai y col, en el 2019, emplearon la metagenómica para determinar la diversidad de microorganismos presentes en la rizosfera de cacahuete (Arachos hypogaea L), en suelos estresados por falta de agua y no estresados. Concluyendo que, en los suelos estresados por falta de agua, los microorganismos mayoritariamente presentes pertenecían a las Actinobacterias y las Acidobacterias, siendo las responsables de la mejor resistencia a la sequía del cacahuete. Por lo que, el conocimiento sobre la relación que existe entre la microbiota de la rizosfera de suelos que padecen sequía, nos pueden ayudar a establecer estrategias de mejora, en cuanto a la adaptación de los cultivos a este tipo de estrés, modificando los microorganismos presentes en el suelo.

En el caso de la ganadería, la digestión de ciertos compuestos de su alimentación, como la celulosa, hemicelulosa o lignina, dependen exclusivamente de la acción de enzimas hidrolíticas que son producidas por microorganismos. A este respecto, la aplicación de la metagenómica es muy útil para identificar nuevos microorganismos que contribuyan a la conversión de estos compuestos de forma más eficiente, para así obtener una mejor y mayor productividad de leche y carne por parte de los animales. Un ejemplo de ello es el estudio llevado a cabo por Pitta y col. (2016), donde estudiaron los microorganismos presentes en el intestino de vaca y como estos influían en la producción de leche. Concluyeron que, en el rumen mayoritariamente se encontraban bacterias del filo Bacteroidetes (70%) y Firmicutes (15-20%), y que su abundancia era independiente de la dieta y la lactancia, pero que los primeros contribuían a una mayor función metabólica en vacas lecheras de primera lactancia, mientras que los segundos aumentaron la función metabólica de vacas de segunda y tercera lactancia.

Por tanto, la metagenómica nos brinda un paso más en el conocimiento de las relaciones microbiota-vegetal y microbiota-animal, que nos abre un camino a seguir para conseguir una agricultura más eficiente y sostenible, al ser capaces de entender mejor como las plantas, los animales y los microorganismos se relacionan entre sí.

6.- Bibliografía

1. Ambardar S, Singh HR, Gowda M, Vakhlu J., 2016. Comparative Metagenomics Reveal Phylum Level Temporal and Spatial Changes in Mycobiome of Belowground Parts of Crocus sativus. PloS One., 11(9):e0163300.
2. Dai L, Zhang G, Yu Z, Ding H, Xu Y, Zhang Z., 2019. Effect of Drought Stress and Developmental Stages on Microbial Community Structure and Diversity in Peanut Rhizosphere Soil. Int J Mol Sci. 2019;20(9)2265.
3. Handelsman, J., 2004. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68:669-685.
4. Hyman, E.D., 1988. A new method of sequencing DNA. Anal Biochem, 174:423–459.
5. Kumar V, AlMomin S, Al-Aqeel H, Al-Salameen F, Nair S, Shajan A., 2018. Metagenomic analysis of rhizosphere microflora of oil-contaminated soil planted with barley and alfalfa. PloS One., 13(8):e0202127.
6. Miller, R. R., Montoya, V., Gardy, J.L., Patrick, D. M. & Tang, P., 2013. Metagenomics for pathogen detection in public health. Genome Medicine, 5(9): 81.
7. Mitra, R.D., Shendure, J., Olejnik, J., Edyta-Krzymanska-Olejnik & Church, G.M., 2003. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies. Anal Biochem, 320:55–65.
8. Nielsen, H. B., Almeida, M., Juncker, A. S., Rasmussen, S., 2014. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes. Nature Biotechnology, 32:822-828.
9. Pitta DW, Indugu N, Kumar S, Vecchiarelli B, Sinha R, Baker LD, et al., 2016. Metagenomic assessment of the functional potential of the rumen microbiome in Holstein dairy cows. Anaerobe, 38:50-60.
10. Putney, S.D., Herliby, W.C. & Schimme,l P.A., 1983. A new tropoin T and cDNA clones for 13 different muscle proteins, found by shotgun sequencing. Nature, 302: 718-721.
11. Rincón-Florez, V., L. Carvalhais, P. Schenk. 2013. Culture-independent molecular tools for soil and rhizosphere microbiology. Diversity 5:581-612.
12. Sanger, F. & Coulson, A.R., 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol, 94:441–449.
13. Tsurumaru H, Okubo T, Okazaki K, Hashimoto M, Kakizaki K, Hanzawa E, et al., 2015. Metagenomic analysis of the bacterial community associated with the taproot of sugar beet. Microbes Environ. 30(1):63-69.
14. Wooley, J. C., Godzik, A. & Friedberg, I., 2010. A primer on metagenomics. PLoS ONE 6:e1000667.

Autor: Dpto. Agronomía Infoagro